ITALIE, 1525 — En plein cœur de la Haute Renaissance, l'Italie est encore déchirée par de nombreuses guerres intestines. Elles rongent le cœur de certains hommes mais affûtent la lame d'une grande majorité qui ne voient pas la menace qui se cache dans l'ombre... Une lutte secrète opposant Templiers et Assassins depuis la nuit des temps, prête à saper à nouveau la belle ville de Rome de l'intérieur, alors que ces sombres années paraissaient révolues depuis la chute des Borgia. La Confrérie d'abord chahutée par le décès du grand Mentor Ezio Auditore accuse un second choc : une trahison de l'un des leurs, livrant des informations capitales à l'Ordre puis les rejoignant, eux, leurs ennemis de toujours. Leur repaire sur l'île Tibérine ainsi dévasté, les Assassins se voient forcés de se replier en plein quartier antique, à Rome, chez leurs alliés de la guilde des voleurs en attendant de pouvoir se relever et contre attaquer. Les Templiers, quant à eux, reprennent du poil de la bête comme jamais. Le peuple, même ignorant du conflit qui se trame, commence à s'interroger sur les troubles naissants qui pour certains, ont comme un goût de déjà vu.